具有APN抑制作用的生物活性肽的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及具有apn抑制作用的生物活性肽。

背景技术：

生物活性肽作为促进健康的生物活性成分，能有效促进机体的功能或改善机体的状态，并具有传递生理信息，调节生理功能的作用。生物活性肽常作为功能性成分用于食品生产，特别是在食品、保健品中的应用方面已经取得良好效果。长期以来，鸡蛋一直被认为是生物活性肽的理想来源。鸡蛋中的生物活性肽在满足基本的营养需求以外还发挥着多种不同的生物学功能，不仅具有抗氧化、抗衰老、抗炎症、抗高血压、降血糖、抗细菌等作用，而且作为免疫调节剂具有调节免疫反应、抗肿瘤等功能，并且能够清除自由基具有延缓衰老的功效。

鸡蛋蛋白被胃蛋白酶和胰蛋白酶分解利用，并发生了一系列生理生化反应，使蛋白质变为多肽或者游离的氨基酸，最终被人体消化吸收或通过小肠上皮细胞的吸收转运直接进入人体的血液循环，并以活性形式和足够剂量的方式运输到靶器官发挥其生物活性作用。

因此，这些生物活性小分子肽不仅是筛选药物的天然资源宝库，也是功能性食品工业的主要原料成分。目前，生物活性肽的制备及其应用开发已经成为世界范围内研究的热点。天天好生物制品有限公司首次在国内利用酶切技术酶解鸡蛋中的卵清蛋白，获得生物活性肽并证明其生理活性。他们发现，利用胃蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解卵清蛋白，从水解物中得到的氨基酸序列arg-ala-asp-his-pro-phe-leu和tyr-ala-glu-glu-arg-tyr-pro-ile-leu，口服12周能够使缓激肽的分解减少，加强血管的舒张作用，使血压下降从而抑制高血压的发展。1991年，tsuge等人从鸡蛋中的卵清蛋白中得到生物活性肽ahk，vhh和vhhanen，研究证明它们具有较好的抗氧化生物学活性。choi等人酶解鸡蛋中的卵黄高磷蛋白得到磷酸肽，结果发现不仅对人体具有抗氧化活性，还增强了钙的生物利用度，增强人体免疫力，减少疾病的发生。

氨肽酶n(apn)是一种锌依赖性金属蛋白酶，广泛存在于如肠上皮，肾，肝，肺细胞等许多细胞中，可以选择性地从肽的n-末端切割氨基酸。apn经常被鉴定为肿瘤细胞表面的过度表达，并与肿瘤的增殖、侵袭、转移和血管生成有关，一直被认为是抗肿瘤治疗的重要目标。同时，apn与炎症、镇痛、癌症、以及调节血压都有关。自1976年首次推出抗apn药物bestatin以来，已有大量apn抑制剂被报道，例如，probestin，lapstatin，ahpa-val等。

尽管鸡蛋蛋白内含有许多具有生物活性的肽序列，但这些生物活性肽序列只有通过一定的手段将其释放出来才能发挥作用。获取蛋源性活性肽的主要手段有两种：①发酵，利用微生物发酵蛋源蛋白获取；②酶解，利用来自动物的消化道酶和来自植物和微生物的蛋白酶。然而，分离和纯化生物活性肽研究周期长且价格昂贵，因此可以通过虚拟筛选的方法来推进这一过程。

技术实现要素：

本发明公开了具有apn抑制作用的生物活性肽，并且可以将其作为保健品成分以及生物药品中有效成分的生物递送的有效载体。

本发明的具有apn抑制作用的生物活性肽，其氨基酸序列分别为cys-asn-arg、cys-asp-arg、gly-glu-phe，其抑制apn活性的半抑制浓度(ic50)分别为8.935、6.42和61.67mm。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

(1)生物活性三肽的筛选

基于在线程序expasypeptidecutter(http：//web.expasy.org/peptide_cutter/)，使用两种典型的胃肠道消化蛋白酶即胃蛋白酶和胰蛋白酶对鸡蛋蛋白序列进行模拟酶解，将酶解后产生的肽序列与biopep(http：//www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/en/biopep)数据库中已报道的apn抑制肽进行比较，筛选获得到未经报道的生物活性三肽cdr、sdf、adf、fyq、gef、ntf、lwk、mir、naf、aqf、cnr。通过peptidepropertycalculator、peptideranker和discoverystudio的admet模块对三肽cdr、sdf、adf、fyq、gef、ntf、lwk、mir、naf、aqf、cnr进行水溶性、生物活性和admet(吸收、分布、代谢、排泄、毒性)性质的预测。筛选得到溶解性好、活性评分高于0.5、无毒的三肽cdr、sdf、gef、adf、lwk、cnr。从pdb数据库(http：//www.rcsb.org/)中获得apn的晶体结构(4fyr)，并将其作为蛋白靶标，通过ds中的cdocker程序进行分子对接来筛选能与apn紧密结合的三肽，并明确活性位点。以结合‘cdocker-interaction-energy’得分、形成氢键的数目及作用的关键氨基酸为指标，筛选得到具有潜在apn抑制活性肽cnr、cdr、gef。

(2)体外apn抑制活性测定

通过酶标仪法对肽cnr、cnr、gef的apn抑制活性进行测定。取20μl活性肽，加入20μl浓度为60u/l的标准品混合均匀，在37℃恒温水浴锅中预热10min，然后取混合液20μl。向酶标包被板中加入30μl样品稀释液，与混合液充分混合后，加入100μl酶标试剂后用封板膜封板，37℃保温60min。将浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。每孔先加50μl显色剂a，再加50μl显色剂b，震荡混匀后，37℃避光显色15min。最后，每孔加50μl终止液，终止反应，15min内进行测定。同时用apn标准品替代混合液作为空白对照组。该反应液用酶标仪进行分析，检测波长为450nm。

利用下列公式计算不同浓度肽的抑制率：

apn抑制活性(％)＝(a-b)/a×100％

其中a是空白对照组的吸光度值，反应空白混合物含有相同体积的缓冲溶液而不是样品；b是apn和酶促肽样品存在下反应的吸光度值，ic50值定义为在测定条件下抑制50％apn活性的抑制剂浓度。

活性肽cnr、cdr、gef的获得可利用胃蛋白酶和胰蛋白酶对鸡蛋蛋白进行酶解并通过多维色谱纯化(凝胶过滤色谱、亲和色谱和半制备液相色谱)实现；也可通过固相化学合成方法实现。

与现有技术相比，本发明生物活性多肽的有益效果为：

本发明从鸡蛋蛋白中筛选得到了具有有效apn抑制作用的生物活性肽cnr、cdr、gef，并明确活性肽cnr、cdr、gef与apn的作用位点；本发明的蛋源性生物活性三肽cnr、cdr、gef具有很好的促进机体免疫力活性和抗肿瘤功能；本发明的生物活性三肽能够增强机体免疫力，提高机体抵御外界病原体感染的能力，降低机体发病率，而且经过胃肠道消化模拟实验能直接吸收不被降解，进入体内不会引起机体的免疫排斥反应。另外，模拟消化实验结果表明这三条生物活性三肽在通常的动物体内消化条件下稳定，不会被进一步降解，能够被动物机体直接吸收利用发挥其具有的生物活性功能，对开发具有抗肿瘤功能的食品、保健品和药品具有十分重要的意义和应用价值。

附图说明

本发明附图3幅，其中：

图1cnr与apn的对接结果的3d图；

图2cdr与apn的对接结果的3d图；

图3gef与apn的对接结果的3d图；

具体实施方式

下面以具体实施例的方式对本发明作进一步的阐述。

实施例1.具有apn抑制作用的活性肽的筛选

通过在线工具expasypeptidecutter(http：//web.expasy.org/peptide_cutter/)的胃蛋白酶和胰蛋白酶对鸡蛋蛋白(卵黏蛋白、抗生物素蛋白、卵转铁蛋白)进行虚拟酶解，将酶解后产生的肽序列与biopep(http：//www.uwm.edu.pl/biochemia/index.php/en/biopep)数据库中已知的apn抑制肽进行比较，筛选获得到未经报道的三肽cdr、sdf、adf、fyq、gef、ntf、lwk、mir、naf、aqf、cnr。通过在线工具peptidepropertycalculator、peptideranker和discoverystudio中的admet程序对三肽cdr、sdf、adf、fyq、gef、ntf、lwk、mir、naf、aqf、cnr进行水溶性、生物活性和admet(吸收、分布、代谢、排泄、毒性)性质的预测。筛选得到溶解性好、活性评分高于0.5、无毒的三肽cdr、sdf、gef、adf、lwk、cnr。

从pdb数据库(http：//www.rcsb.org/)中获得apn的晶体结构(4fyr)，并将其作为蛋白靶标，通过ds中的cdocker程序进行分子对接来评价肽与apn紧密结合能力。结合‘cdocker-interaction-energy’得分、形成氢键的数目及作用的关键氨基酸，筛选得到具有潜在apn抑制活性的三肽cnr、cdr、gef。结果表明cnr可以与apn的主要残基即glu355、his392、his388、glu411、tyr477、arg363、ala353和arg381结合(图1)；cdr可以与apn的主要残基即glu411、glu355、his388、his392、tyr477和glu389结合(图2)；gef可以与apn的主要残基即ala351、tyr477、gly352、arg381、glu411、glu355、his388和his392结合(图3)。

实施例2.体外apn抑制活性鉴定

通过酶标仪法对肽cnr、cnr和gef的apn抑制活性进行测定。取20μl活性肽，加入20μl浓度为60u/l的标准品混合均匀，在37℃恒温水浴锅中预热10min，然后取混合液20μl。向酶标包被板中加入30μl样品稀释液，与混合液充分混合后，加入100μl酶标试剂后用封板膜封板，37℃保温60min。将浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此重复5次，拍干。每孔先加50μl显色剂a，再加50μl显色剂b，震荡混匀后，37℃避光显色15min。最后，每孔加50μl终止液，终止反应，15min内进行测定。同时用apn标准品替代混合液作为空白对照组。该反应液用酶标仪进行分析，检测波长为450nm。

利用下列公式计算不同浓度三肽的抑制率：

apn抑制活性(％)＝(a-b)/a×100％

其中a是空白对照组的吸光度值，反应空白混合物含有相同体积的缓冲溶液而不是样品；b是apn和酶促肽样品存在下反应的吸光度值，ic50值定义为在测定条件下抑制50％apn活性的抑制剂浓度。

结果表明cnr、cdr和gef可有效抑制apn的活性，其ic50值分别为8.935、6.42和61.67mm。

以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围的前提下，还可以做出各种变化和变型，这些变化和变型也应视为本发明的保护范围。

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