一种具有α－糖苷酶抑制活性的中药提取物的制备方法及用途的制作方法

专利名称：一种具有α－糖苷酶抑制活性的中药提取物的制备方法及用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种从中药鸭跖草中提取得到的有效部位的方法，该有效部位具有α-糖苷酶抑制活性，在糖尿病、肝炎等疾病的治疗中具有应用价值。
背景技术：
糖尿病，中医称为“消渴”，是一种常见的、病因和生病机理十分复杂的慢性内分泌代谢病。主要特征为高血糖、糖尿、葡萄糖耐量减低及胰岛素释放试验异常等，临床上早期无任何症状，及至症状期，才有多食、多饮、多尿和消瘦“三多一少”等症群，久病者常伴发心血管、肾、神经、皮肤及眼等组织器官的病变，并危及到生命。目前，还没有治愈糖尿病的药物，临床治疗原则在于近期要控制好血糖，远期防止并发症的发生。
糖尿病对健康的危害主要是高血糖引起的慢性微血管、大血管和神经系统并发症。以往认为基础血糖高是导致并发症的主要原因，故对糖尿病治疗以空腹血糖为疗效评价指标，而近年来英国糖尿病前瞻性调查(UKPDS)和其它权威组织(如NIH)的临床流行病学资料显示，餐后二小时的血糖水平与并发症的发病率关系最密切，故目前在糖尿病治疗中抑制糖分解，延缓糖吸收，控制餐后高血糖的α-葡糖苷酶抑制剂越来越受到临床医生的青睐。
α-葡糖苷酶有多种，包括①蔗糖酶，促使蔗糖水解生成果糖及葡萄糖；②葡萄糖淀粉酶，麦芽糖酶及糊精酶，促使从淀粉水解生成的寡糖水解生成葡萄糖。食物中的淀粉(多糖)经口腔唾液、胰淀粉酶消化成含少数葡萄糖分子的低聚糖(或称寡糖)以及双糖与三糖，进入小肠经α-葡萄糖苷酶作用下分解为单个葡萄糖，为小肠吸收。在生理状态下，小肠上，中、下三段均存在α-葡萄糖苷酶，在服用α-葡萄糖苷酶抑制剂后上段可被抑制，而糖的吸收仅在中、下段，故吸收面积减少，吸收时间后延，从而对降低餐后高血糖有益，在长期使用后亦可降低空腹血糖，估计与提高胰岛素敏感性有关。α-葡糖苷酶抑制剂适用于各种糖尿病患者，非胰岛素依赖型(II型)糖尿病患者经饮食与运动治疗后，血糖控制不理想时可作为首选，尤适于肥胖患者。而且可与磺脲类、双胍类药联合使用。
1966年，人们从链球菌的发酵培养液中首次发现天然糖的类似物1-Nojirimycin(2-羟甲基-3，4，5，6-四羟基吡啶)，证实具有α和β-糖苷酶抑制活性。其后又不断有新的糖苷酶抑制剂被发现，各类α-糖苷酶抑制剂结构上共同的特点是存在拟单糖结构，亦即有一个多羟基的六元环或五元环结构。以六元环为例，其可为环己烷、环己烯、吡喃或吡啶等。若环中带有氮原子则为生物碱类，这是一类最主要的α-糖苷酶抑制剂，结构上大致可分为七类多羟哌啶类、四氢吡咯类、二氢吡咯类、吲哚拉西啶类、吡咯双烷类和托烷类等。除生物碱类外，某些黄酮类、环烷类等也具有α-糖苷酶抑制活性的效应。目前已经有多个α-糖苷酶抑制剂开发上市，如阿卡波糖、伏格列波糖、米格列醇等，用于糖尿病治疗。
据《中华本草》(上海科学技术出版社，1999年出版)记载，鸭跖草为鸭跖草科植物鸭跖草的全草，始载于《本草拾遗》。异名鸡舌草、鼻斫草、碧竹子《本草拾遗》，青耳环花、碧蟾蜍、竹叶草《竹谱详录》，鸭脚草、耳环草、碧蝉儿花《百一选方》，地地藕《滇南本草》，蓝姑草《活幼全书》，竹鸡草，《濒湖集简方》，竹叶菜、淡竹叶、碧蝉花《纲目》，水竹子《植物名实图考长编》，露草、帽子花《植物学大辞典》，竹叶兰《贵阳民间药草》，竹根菜《四川中药志》，鹅儿菜《广西中草药》，竹管草《江西草药》，兰花草、野靛青、萤火虫草、竹叶活血丹《浙江民间常用草药》，鸡冠菜、蓝花姑娘《江苏药材志》，鸭仔草《福建中草药》。
中药鸭跖草的原植物为鸭跖草(commelina communis L.)，系一年生草本，植株高15～60cm。多有须根，茎多分枝，具纵棱，基部匍匐，上部直立，仅叶鞘及茎上部被短毛。单叶互生，无柄或近无柄；叶片卵圆状披针形或披针形，长4～10cm，宽1～3cm，先端渐尖，基部下延成膜质鞘，抱茎，有白色缘毛，全缘。总苞片佛焰苞状，有1.5～4cm长的的柄，与叶对生，心形，梢镰刀状弯曲，先端短急尖，长1.5～2.4cm，边缘常有硬毛。聚伞花序生于枝上部者，花3～4朵，具短梗，生于枝最下部者，有花一朵，梗长约8mm；萼片3，卵形，长约5mm，宽约3mm，膜质；花瓣3，深蓝色，较小的一片卵形，长约9mm，较大的2片近圆形，有长爪，长约15mm，雄蕊6，能育者3枚，花丝长约13mm，不育者3枚，花丝较短，无毛，先端蝴蝶状；雌蕊1，子房上位，卵形，花柱丝状而长。蒴果椭圆形，长5～7mm，2室，2瓣裂，每室种子两颗。种子长2～3mm，表面凹凸不平，具白色小点。花期7～9月，果期9～10月。生于海拔100～2400m的湿润阴处，在沟边、路边、田埂、荒地、宅旁墙角、山坡及林缘草丛中均常见。分布于我国南北大部分地区。
中药鸭跖草的主要炮制方法为取原药材，除去杂质，抢水洗净，及时切段，干燥。饮片性状全草长至60cm，黄绿色，老茎略呈方形，表面光滑，具数条纵棱，直径约2mm，节膨大，基部节上常有须根；断面坚实，中部有髓。叶互生，皱缩成团，质薄脆，易碎；完整叶片展平后卵状披针形或披针形，长3～9cm，宽1～3cm，先端尖，全缘，基部下延成膜质鞘，抱茎，叶脉平行。聚伞花序，总苞心状卵形，折合状，边缘不相连；花多脱落，萼片膜质，花瓣蓝黑色。气微，味甘、淡。以色黄绿者为佳。储藏于干燥容器内，置通风干燥处，防霉。
传统中医认为鸭跖草味甘、淡，性寒。归肺、胃、膀胱经。具有清热解毒，利水消肿之功能。主治风热感冒，热病发热，咽喉肿痛，痈肿疔毒，水肿，小便热淋涩痛。用法用量内服煎汤，15～30克；鲜品60～90克，或捣汁。外用适量，捣敷。
已经发现的鸭跖草的化学成分有全草含左旋—黑麦草内酯(loliolide)，无羁萜(friedelin)，β-谷甾醇(β-sitosterol)。对-羟基桂皮酸(ρ-hydroxy-cinnamic acid)，胡萝卜甙(dancosterol)和D-甘露醇(mannose)及正三十烷醇(n-triacontanol)等。地上部分含生物碱1-甲氧羰基-β-咔啉(1-carbomethoxy-β-carboline)，哈尔满(harman)及去甲哈尔满(norharman)，1-脱氧野尻霉素(1-Nojirimycin)等。
本发明的发明人经大量深入研究后证明，提取自鸭跖草的，以多羟基生物碱(1-脱氧野尻霉素为代表)为化学本质的有效部位对α-糖苷酶具有抑制活性，含该有效部位的药物可用作治疗糖尿病、肥胖症及爱滋病等疾病。

发明内容
本发明的目的就是提供一种具有α-糖苷酶抑制活性的中药提取物的制备方法及用途。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现一种具有α-糖苷酶抑制活性的中药提取物的制备方法，其特征在于，该中药提取物从中药鸭跖草中提取分离有效部位得到；其工艺步骤如下首先将中药鸭跖草经过粉碎后，用水或醇或含醇类溶剂，室温或加热回流提取，提取溶剂量为原药重量的5～15倍，重复提取1～3次；然后滤去药渣，滤液在常压或减压状态下浓缩，通过醇沉或絮凝工艺，使杂质沉淀，再离心或过滤除去不溶物；再将上清液或滤液上阳离子交换树脂，以蒸溜水洗尽不吸附的杂质，用0.2～1N的氨水溶液洗脱，洗脱液浓缩，经真空干燥或冷冻干燥成干粉，或将洗脱液直接喷雾干燥成干粉。
所述的提取溶剂为水，温度25～100℃，水用量为原药重量的8～10倍。
所述的提取溶剂为醇，该醇选自甲醇、乙醇、异丙醇或丁醇中的一种。
所述的滤液在常压或减压状态下浓缩，其中的减压状态为0.09～0.1Mpa。
所述的醇沉工艺为滤液浓缩到小体积后加乙醇或甲醇至总浓度为50～80％(体积)，4℃放置过夜，离心去沉淀。
所述的絮凝工艺为将滤液浓缩到生药量与体积比为10∶1时加甲壳素或澄清剂，70～80℃保温5小时后，离心去沉淀。
所述的过滤工艺包括常压或减压过滤、微滤、超滤。
所述的阳离子交换树脂可采用苯乙烯系树脂，包括型号001×4，001×7，阿姆伯利特IR120(Amberlite IR120)，也可采用大孔型树脂，包括型号阿姆伯利特252(Amberlite 252)。
所述的的干粉产品中含生物碱50～60％(重量)。
一种具有α-糖苷酶抑制活性的中药提取物的用途，其特征在于，该具有α-糖苷酶抑制活性的中药提取物用于制备降血糖药物。
以上制备的干粉，为棕黄色固体物质，易吸潮。其中所含生物碱约为总重量的50％～60％。以上制备的总生物碱干粉，加入相关辅料，可制成片剂、胶囊等剂型。
按以下方法控制其产品质量
1)生物碱鉴别反应取干粉少量，于适量水中溶解，加入数滴6N HCl，滴加硅钨酸试液，有灰白色至黄色沉淀生成；或滴加碘化铋钾试液，有棕黄色沉淀生成。
2)酸碱滴定取上述干粉0.5克，溶于20ml冰乙酸中，以0.1N高氯酸为滴定液，测得其中N原子当量数。再取上述干粉0.5克，溶于20ml水中，以0.1N NaOH为滴定液，测得其中羧酸根当量数。N原子当量数减去羧酸根当量数应为生物碱的摩尔数，生物碱分子量以180计，所算得的生物碱重量应不低于总重量的30％。
3)薄层扫描法以EMERK产HPTLC硅胶薄层板为载体，氯仿-乙醇-氨水(2∶3∶1)为展开剂，O-Tolidine试液显色。以1-脱氧野尻霉素为对照品(1mg/ml)，供试品配成10mg/ml浓度的溶液，供试品和对照品以全自动点样仪点样于同一薄层板上(点样量2μl)。展层结束后，喷洒O-Tolidine试液，489nm扫描，摄像后积分分析。按外标法以各峰面积计算，本品含总生物碱以不低于50％。
本发明方法从鸭跖草中可提取分离到一个新的对α-糖苷酶具有抑制活性的部位，其化学本质为多羟基生物碱类，它对正常或糖尿病小鼠均有降低餐后血糖作用。对于人而言，本发明的中药组提取物及其进一步开发的制剂也可降低血糖浓度，用于治疗糖尿病(消渴)、肥胖症等疾病，其用法为100-300mg/次，一日三次。

图1为鸭跖草总生物碱对α-糖苷酶的体外抑制活性示意图。
具体实施例方式
下面将结合具体实施例及实验，对本发明作进一步说明。
实施例1鸭跖草1000g，加水8L，煮沸2小时，过滤。滤渣再加6L水，煮沸2小时，过滤。合并两次滤液，浓缩到小体积，加乙醇至总浓度为60％，4℃放置过夜，离心去沉淀。离心后上清液过已处理好的Amberlite IR120(H+)阳离子交换柱，用去离子水彻底冲洗未吸附物，然后用0.5N氨水溶液洗脱，待pH值变碱、硅钨酸反应阳性时开始收集，硅钨酸反应阴性时结束，把收集液浓缩、真空干燥，得8g棕色的提取物(为总生物碱)。
实施例2鸭跖草1000g，加30％乙醇8L，微沸状态下保温2小时，过滤。滤渣再加6L水，微沸状态下保温2小时，过滤。合并两次滤液，浓缩到小体积，加乙醇至总浓度为60％，4℃放置过夜，离心去沉淀。离心后上清液过已处理好的Amberlite IR120(H+)阳离子交换柱，用去离子水彻底冲洗未吸附物，然后用0.5N氨水溶液洗脱，待pH值变碱、硅钨酸反应阳性时开始收集，硅钨酸反应阳性时开始收集，硅钨酸反应阴性时结束，把收集液浓缩、真空干燥，得6g棕色的提取物(为总生物碱)。
实施例3鸭跖草1000g，加50％乙醇8L，回流2小时，过滤。滤渣再加50％甲醇6L，回流2小时，过滤。合并两次滤液，浓缩到小体积，加甲醇至总浓度为50％，4℃放置过夜，离心去沉淀。离心后上清液过已处理好的Amberlite IR120(H+)阳离子交换柱，用去离子水彻底冲洗未吸附物，然后用0.5N氨水溶液洗脱，待pH值变碱、硅钨酸反应阳性时开始收集，硅钨酸反应阳性时开始收集，硅钨酸反应阴性时结束，把收集液浓缩、真空干燥，得5g棕色的提取物(为总生物碱)。
实验1体外糖苷酶抑制实验酶液的制备13周龄的ICR小鼠小肠(近空长约6cm)，生理盐水冲洗，刮粘膜层，加匀浆缓冲液(0.5M NaCl，0.5M KCl，5mM EDTA，pH7.0)进行匀浆，20000g×30min离心，沉淀里加匀浆缓冲液，离心，沉淀加生理盐水，3000g×40min离心，上清液为酶液(-20℃保存)。
α-糖苷酶活性测定底物为PNPG，购自Emark公司，以pNP(p-硝基苯酚)法测定其活性，405nm处吸光度的变化来测定p-Nitrophenol生成量，硝基苯酚的形成速率与酶的活性成正比，pH 7.0 37℃条件下，1分钟内生成1μM p-Nitrophenol的酶量为1单位(U)。具体方法如下10μl缓冲液+50μl底物→37℃ 5min→加酶50μl→37℃ 15min→0.2M Na2CO3190μl→读数。以不加酶上清液及受试药物的反应体系为空白管调零，以不加受试药物反应体系管为100％，并设拜唐苹(Acarbose)为阳性对照管，加入实例1所得总生物碱(以相应缓冲液溶解)，计算该总生物碱对酶的抑制百分率。结果得到当酶活性抑制率为42％-99％时，上述总生物碱的浓度为7.8-1000μg/ml，IC50为10.6μg/ml，结果见图1。
实验2鸭跖草总生物碱对正常小鼠糖耐量的影响昆明种雄性小鼠体重为22～25g，共分为6组，即空腹组、对照组、拜唐苹组、小剂量组、中剂量组、大剂量组，均禁20小时，除了空腹组灌生理盐水外，其他各组均灌胃淀粉5g/kg，同时对照组灌胃生理盐水、拜唐苹组灌胃拜唐苹50mg/kg、本品分三个剂量组与淀粉同时灌胃给药小剂量组100mg/kg、中剂量组200mg/kg、大剂量组300mg/kg。给药后30min测血糖水平，结果见表1。
表1.鸭跖草总生物碱对正常小鼠糖耐量的影响组别剂量(mg/kg)动物数(只)血糖值(mmol/L)空腹组 - 6 4.95±0.43对照组 - 1019.0±3.44#拜唐苹组25 8 4.1±0.76*小剂量组25 1010.66±3.0*中剂量组50 109.34±2.05*大剂量组100105.73±1.52*#P＜0.01v.s.空腹组，*P＜0.01v.s.对照组实验3鸭跖草总生物碱对STZ诱导的糖尿病小鼠糖耐量的影响昆明种小鼠体重为22～25g，禁食后腹腔注射STZ 200mg/kg(用pH4.2的0.1M柠檬酸钠缓冲液临时配置，在冰上操作)，72小时后测血糖值11.1mmol/L以上者进行实验，分组时各组动物平均血糖值相差不大于6mmol/L，小鼠共分为6组，即空腹组、对照组、拜唐苹组、小剂量组、中剂量组、大剂量组，均禁食20小时，除了空腹组灌生理盐水外，其他各组均灌胃淀粉5g/kg，同时对照组灌胃生理盐水、拜唐苹组灌胃拜唐苹50mg/kg、本品分三个剂量小剂量组100mg/kg、中剂量组200mg/kg、大剂量组300mg/kg。给药后30min测血糖水平，结果见表2。
表2.鸭跖草总生物碱对STZ诱导的糖尿病小鼠糖耐量的影响组别剂量(mg/kg)动物数(只)血糖值(mmol/L)空腹组 - 6 4.95±0.43对照组 - 1029.0±3.85#拜唐苹组25 8 12.2±0.89*小剂量组25 1018.9±3.5*中剂量组50 1016.4±2.23*大剂量组1001013.7±1.96*#P＜0.01v.s.空腹组，*P＜0.01v.s.对照组
权利要求
1.一种具有α-糖苷酶抑制活性的中药提取物的制备方法，其特征在于，该中药提取物从中药鸭跖草中提取分离有效部位得到；其工艺步骤如下首先将中药鸭跖草经过粉碎后，用水或醇或含醇类溶剂，室温或加热回流提取，提取溶剂量为原药重量的5～15倍，重复提取1～3次；然后滤去药渣，滤液在常压或减压状态下浓缩，通过醇沉或絮凝工艺，使杂质沉淀，再离心或过滤除去不溶物；再将上清液或滤液上阳离子交换树脂，以蒸溜水洗尽不吸附的杂质，用0.2～1N的氨水溶液洗脱，洗脱液浓缩，经真空干燥或冷冻干燥成干粉，或将洗脱液直接喷雾干燥成干粉。
2.根据权利要求1所述的一种具有α-糖苷酶抑制活性的中药提取物的制备方法，其特征在于，所述的提取溶剂为水，温度25～100℃，水用量为原药重量的8～10倍。
3.根据权利要求1所述的一种具有α-糖苷酶抑制活性的中药提取物的制备方法，其特征在于，所述的提取溶剂为醇，该醇选自甲醇、乙醇、异丙醇或丁醇中的一种。
4.根据权利要求1所述的一种具有α-糖苷酶抑制活性的中药提取物的制备方法，其特征在于，所述的滤液在常压或减压状态下浓缩，其中的减压状态为0.09～0.1Mpa。
5.根据权利要求1所述的一种具有α-糖苷酶抑制活性的中药提取物的制备方法，其特征在于，所述的醇沉工艺为滤液浓缩到小体积后加乙醇或甲醇至总浓度为50～80％(体积)，4℃放置过夜，离心去沉淀。
6.根据权利要求1所述的一种具有α-糖苷酶抑制活性的中药提取物的制备方法，其特征在于，所述的絮凝工艺为将滤液浓缩到生药量与体积比为10∶1时加甲壳素或澄清剂，70～80℃保温5小时后，离心去沉淀。
7.根据权利要求1所述的一种具有α-糖苷酶抑制活性的中药提取物的制备方法，其特征在于，所述的过滤工艺包括常压或减压过滤、微滤、超滤。
8.根据权利要求1所述的一种具有α-糖苷酶抑制活性的中药提取物的制备方法，其特征在于，所述的阳离子交换树脂可采用苯乙烯系树脂，包括型号001×4，001×7，阿姆伯利特IR120(Amberlite IR120)，也可采用大孔型树脂，包括型号阿姆伯利特252(Amberlite 252)。
9.根据权利要求1所述的一种具有α-糖苷酶抑制活性的中药提取物的制备方法，其特征在于，所述的的干粉产品中含生物碱50～60％(重量)。
10.一种具有α-糖苷酶抑制活性的中药提取物的用途，其特征在于，该具有α-糖苷酶抑制活性的中药提取物用于制备降血糖药物。
全文摘要
本发明涉及一种具有α－糖苷酶抑制活性的中药提取物的制备方法及用途，它是通过用5－15倍重量比的水、醇或含水醇溶剂，在室温或加热回流下提取粉碎的鸭跖草，然后浓缩，浓缩液加入适量乙醇，去除沉淀，上清液通过离子交换色谱法分离纯化，得到由含量超过50％的总生物碱构成的中药组分；本发明制备的中药组提取物可用于制备降血糖药物以及制备治疗肝炎、感冒、艾滋病等病毒性疾病以及肥胖症的药物。
文档编号A61P3/00GK1471944SQ0213631
公开日2004年2月4日 申请日期2002年7月31日 优先权日2002年7月31日
发明者黄哲, 王作鹏, 张立红, 黄 哲 申请人:上海复旦张江生物医药股份有限公司

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